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細(xì)胞或組織總蛋白提取與濃度測定（BCA法）

實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞或組織總蛋白提取與濃度測定

1 細(xì)胞總蛋白提?。ū戏乐沟鞍琢呀猓?/span>

1）吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入1 ml預(yù)冷PBS緩沖液洗3次。

2）加入適量含1×蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液（10 cm培養(yǎng)皿中一般加入500 μl,六孔板一般100微）。

3）冰上裂解15-30 min，將裂解后的細(xì)胞用細(xì)胞刮子刮下，吸入1.5ml離心管中。（這個裂解時間的長短有沒有影響不清楚，本人之前刮細(xì)胞太慢，常常往后一個刮完后前面一個已經(jīng)裂解了好久，可能都要一個小時了，應(yīng)該問題不大）

4）在4℃條件下，12,000 rpm離心15 min，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。

2 小鼠組織總蛋白提取

1）取小鼠組織約50-200 mg，加入500 μl預(yù)冷的含1×蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液。

2）將小鼠組織剪碎，并用組織勻漿器勻漿。

3）冰上靜置30 min。

4）在4℃條件下，12,000 rpm離心30 min。收集上清，即為組織總蛋白。

3 蛋白濃度測定（BCA法）

利用北京普利萊的BCA蛋白定量試劑盒（P1511）進(jìn)行蛋白濃度測定，具體操作步驟如下：

1）將BCA蛋白定量試劑盒中的BCA Reagent和Cu Reagent按照50:1的比例配制成BCA工作液。

2）將4 mg/ml的BSA溶液倍比稀釋，配置成濃度為4、2、1、0.5、0.25及0.125 mg/ml的BSA溶液作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

3）在96孔板中每孔加入100 μl BCA工作液，再加入5 μl蛋白樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，每個蛋白樣品需設(shè)兩個平行孔，充分混勻，注意盡量避免出現(xiàn)氣泡，37℃孵育30 min。

以BCA溶液作為空白對照，使用酶標(biāo)儀測定595nm處的吸光度值。通過酶標(biāo)儀自帶軟件擬合曲線并計算每個樣品的蛋白濃度。

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織裂解液。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。根據(jù)其裂解液的強(qiáng)度大致可以分為強(qiáng)、中、弱三類。（感覺這個總結(jié)不錯）弱的裂解液適合做co-ip，如果是胞漿蛋白，對裂解液強(qiáng)度要求不高，如果是膜蛋白，要強(qiáng)裂解液。加了SDS裂解能力就比較強(qiáng)。